双脑中心大讲堂第13期 | Edward M. Callaway院士学术报告

5月18日上午，双脑中心采用线上线下相结合的方式，在紫金港校区医学院综合楼705报告厅及Zoom、钉钉直播平台举办了双脑中心大讲堂暨医学院“浙医筑峰——110周年学术论坛”。本场活动荣幸邀请到美国国家科学院院士、Salk研究所Edward M. Callaway教授，以《Advantages and Limitations of Monosynaptic, Cell type-specific Neural circuit tracing with G-deleted Rabies viruses》为题，向老师和同学们详细展示了他实验室所开发的具有突破性意义的神经生物学技术。

脑科学与脑医学学院副院长斯科教授，院长助理高志华教授等人参加了本次报告会，报告由斯科教授主持，斯科教授代表医学院向Edward M. Callaway院士赠送了“浙江大学医学院110周年庆学术论坛”纪念牌，并由李培超研究员暂为代收。Edward M. Callaway院士表示衷心希望疫情早日结束，能够来杭州与大家面对面交流。

Callaway教授首先向大家展示了他实验室于2007年首先发表在Neuron上的一张神经元图。他的研究团队通过基因编辑的手段，将狂犬病毒（Rabies virus，RV）中用于跨突触传播的糖蛋白基因（G）敲除后，以一个荧光基因（如EGFP）替代，就形成了糖蛋白基因缺失（G-deleted, dG）的狂犬病毒基因组。该基因组可以用狂犬病毒的包膜蛋白（含糖蛋白）包裹，做成G+RVdG病毒；也可用A亚类Avian sarcoma and leukosis virus（ASLV-A）的包膜蛋白（EnvA）包裹，做成EnvA+RVdG的假病毒（pseudotype virus）。如果在某类或某个起始神经元中特异性地表达可与EnvA结合的TVA蛋白以及狂犬病毒糖蛋白，EnvA+RVdG就能特异地感染该（类）起始细胞，并进一步感染与之有直接突触连接的神经元，然后停止传播，从而实现了细胞特异性的跨单突触逆向示踪。

这种细胞特异性示踪技术，使得神经生物学家们能够在复杂致密的神经网络中抽丝剥茧，更方便地寻找与特定神经元连接的功能环路。以视觉皮层中的锥体神经元为例，Callaway教授实验室使用光照释放谷氨酸（Uncaging glutamate using light, 即Photostimulation）的方法，在大鼠脑片上发现，视皮层第2/3层的兴奋性神经元之间若有相互连接，它们一般拥有来自第4层及2/3层的共同输入；若没有相互连接，则很少有共同输入。但是不管2/3层的兴奋性神经元之间是否有相互连接，它们都接收来自第5层神经元的兴奋性输入和第2/3层及4层的抑制性输入（详见Yoshimura et al., Nature, 2005）。该发现是在G-deleted Rabies virus示踪技术出现之前做出的，只能在离体脑片上进行实验。G-deleted Rabies virus示踪技术出现后，瑞士的Roska教授实验室利用该技术，在活体小鼠视皮层中，用GCaMP6s逆向标记了与某个锥体神经元有连接的突触前神经元，然后对这群神经元进行双光子钙信号成像。他们发现，小鼠视皮层中不同层之间的神经元连接有‘feature-locked’和‘feature-variant’两类特异性方式（详见Wertz et al., Science, 2015），这在活体动物上验证了Callaway教授实验室的发现，也说明了G-deleted Rabies virus示踪技术在活体动物上研究特异性细胞的连接方式和功能的可行性。

接下来，Callaway教授探讨了G-deleted Rabies virus示踪技术的可靠性问题。已知的实验结果表明，G-deleted Rabies virus在中枢神经系统中标记的神经元都是与起始细胞有直接突触连接的神经元，即没有假阳性标记。但是，也存在已知连接没有被标记上（如，非突触连接不会被标记）或标记效率低的问题，即存在假阴性。为了研究这一问题，Callaway教授实验室正对G-deleted Rabies virus标记的神经元进行RNA测序，希望能够从基因表达层面观测G-deleted Rabies virus对神经元转录组的影响。从测序及共聚类的结果来看，与未被感染的神经元相比，在被感染的神经元中，有些基因表达水平提高，而有些基因表达水平降低，甚至完全不表达。这种调节与神经元的细胞类型有关，也与基因类型有关，例如，SST神经元被感染后Sst基因会被完全抑制，但是Grin3a基因所受影响很小。

最后，Callaway教授还与大家分享了G-deleted Rabies virus对不同细胞类型，以及对远端与近端树突标记效率的最新研究进展。他的团队设计了一个同时带有PSD95 GFP和SynPh RFP的G-deleted Rabies virus，使得突触后的兴奋性神经元被标记为绿色，而突触前神经元会被标记为红色。运用Airyscan成像技术，在突触水平的空间分辨率，定量分析了G-deleted Rabies virus跨突触标记的效率。目前的实验表明，G-deleted Rabies virus大概标记了25-30%的兴奋性输入，该效率依赖于使用病毒的滴度以及糖蛋白的表达水平。此外，标记效率在不同类型的起始细胞之间无显著性差异，在与胞体不同距离的树突之间也无显著性差异。

在报告会交流讨论环节，线上线下师生针对技术的特异性、可靠性等方面踊跃提问，Callaway教授一一详细地做了解答。

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